Lupo fuori e Cane dentro?

Cari Utenti,
 Nei giorni scorsi è uscito per un'importante rivista scientifica un articolo al quale ho avuto l'onore di collaborare. Un articolo che riassume un progetto di studio del genoma del CLC con le più recenti tecniche di indagine genetica e che ha visto la collaborazione di importanti Università Europee (Praga, Ostrava, Alborg, Lviv, Bologna e Padova), dell'ISPRA, del WWF e di CLC-Italia. Nelle prossime righe ho cercato di tradurre e condensare mesi di lavoro e diverse decine di pagine di studio che possano essere una lettura interessante e il più possibile alla portata di tutti, spero di esserci riuscito al meglio.
Nel testo sono stati inseriti alcuni link di approfondimento alle parti più tecniche dello studio; inoltre, i riferimenti biografici sono stati rimossi per rendere la lettura più scorrevole: ovviamente sono a disposizione di tutti nella versione originale, in inglese, della relazione che potete trovare qui.Vi auguro, quindi, una buona lettura per questo primo, affascinante viaggio nel mondo del DNA del Cane Lupo Cecoslovacco.
Vi ricordo che alla Monografica del 2 settembre, allo Stand WGI Project sarò a disposizione per approfondimenti e domande.

Sin dal tardo Pleistocene, l'uomo ha inseguito sia indirettamente che volontariamente l'addomesticamento di varie specie animali e vegetali selvatiche con il fine di sfruttarle per la produzione di alimenti, di materiali, di sicurezza e d'intrattenimento. Nel corso del tempo, un numero crescente di specie è stato selezionato attraverso incroci controllati con lo scopo di fissare artificialmente, o migliorare, tratti morfologici considerati necessari e/o comportamenti desiderati e questo, con il passare delle generazioni, ha portato alla nascita di un'enorme varietà di razze utili all'uomo sempre più distanti dai progenitori selvatici dai quali era partita la loro selezione.
Al giorno d'oggi, tuttavia, si può notare una tendenza inversa. Si sta cercando di ottenere razze che abbiano caratteristiche sempre più simili ai loro antenati selvatici che ai loro corrispettivi domestici. Un esempio evidente di tale tendenza è rappresentato dalla crescente popolarità di razze di cane lupo disponibili al grande pubblico, come ad esempio il Cane Lupo di Saarloos, il Lupo Italiano, il Cane Lupo di Kunming, gli Amercan Wolfdog e il Cane Lupo Cecoslovacco, tutti creati dall'incrocio voluto e deliberato tra razze lupoidi o antiche (il Pastore Tedesco, l'Husky o l'Alaskan Malamute) con lupi selvatici e che, quindi, rappresentano casi estremi di ibridazione antropogenica.
Il Cane Lupo Cecoslovacco (CLC) è il più diffuso tra le razze di questo tipo con attualmente (2016) circa 25.000 individui registrati nel mondo. I CLC sono il risultato di un esperimento militare condotto in Cecoslovacchia negli anni '50. L'obiettivo era quello di creare una nuova razza di cane che mostrasse il temperamento e la controllabilità del Pastore Tedesco insieme alla forza e alle capacità sensoriali del Lupo Carpatico così da aiutare l'esercito cecoslovacco a pattugliare i confini del paese. La prima cucciolata fu ottenuta nel 1958 incrociando un lupo carpatico femmina, Brita, con un pastore tedesco maschio, Cezar. Il lupo, nel processo di creazione della discendenza di questa prima cucciolata, venne usato solo altre quattro volte: nel 1960 sempre con Brita, nel 1968 con un maschio di lupo di nome Argo, nel 1974 con un altro maschio di lupo chiamato Sarik e, infine, nel 1983, di nuovo con una femmina, Lejdy. Alla fine dell'esperimento militare, dopo un riconoscimento temporaneo nel 1989, nel 1999 la razza è stata ufficialmente riconosciuta dalla Fédération Cynologique Internationale (FCI) con un proprio standard (il n. 332), che richiede una morfologia quanto più possibile simile al lupo ma contemporaneamente  anche la docilità e la lealtà nei confronti del proprietario.
Dopo il riconoscimento del 1999, qualsiasi incrocio con lupi o altre razze di cani è stato severamente vietato; nonostante il divieto, l'aspetto del CLC si è mantenuto sempre in linea con gli standard previsti per la razza.
La razza, anche se molto giovane, si trova già a fare i conti con una serie di problematiche che, tuttavia, ci si aspettava potessero incorrere con una selezione così poco antica e con così pochi fondatori. La prima di queste problematiche è il rischio di arrivare al punto di avere una ridotta variabilità genetica e alti livelli di consanguineità. Ad oggi nessuno studio genetico, per quanto eseguito solo su un numero limitato di loci genetici, inclusi microsatelliti (ossia i marcatori scelti in genetica forense) autosomici (non legati al sesso del soggetto), cromosomici Y (specifici delle linee maschili) e marcatori del DNA mitocondriale (specifici delle linee femminili), ha mai dato evidenze in tal senso.

La seconda problematica riguarda molte malattie e disturbi recessivi, spesso riscontrati nel Pastore tedesco, che possono, però, influenzare anche i CLC, come ad es. la displasia dell'anca, una malattia di derivazione multifattoriale che interessa l'articolazione femorale, che è stata riscontrata in circa il 15% dei soggetti analizzati e si stima abbia una componente ereditaria di circa il 30%. Negli ultimi anni, poi, un certo numero di altre malattie hanno iniziato ad interessare il CLC; alcune di queste hanno una base genetica nota, come il Nanismo Ipofisiario, che è originato da una singola mutazione sul gene LHX3, o la Mielopatia Degenerativa, causata principalmente da una mutazione recessiva sul gene SOD1; altre, invece, hanno per ora un'origine sconosciuta o di tipo multifattoriale, come il monorchidismo, l'emangiosarcoma o la stenosi sub-aortica.

L'ultima problematica, infine, è rappresentata da incroci illegali con lupi che mirano a creare animali con un aspetto ancora più simile al lupo, e che quindi, spesso, vengono venduti a prezzi molto più alti della media di razza. Questi ibridi presentano, ovviamente, anche una gestione molto più complessa causata spesso da temperamento molto meno prevedibile (sono, di fatto, più soggetti a risposte istintive a determinati stimoli e motivazioni) a sua volta causato, probabilmente, dalla rottura della composizione genetica e delle interazioni epistatiche (ossia quando un gene influenza l'espressione fenotipica di un altro gene) stabilite durante diversi decenni di selezione artificiale dei tratti comportamentali del CLC. La preoccupazione maggiore è che, se questi incroci venissero abbandonati in natura o fuggissero, potrebbero più facilmente ibridarsi con i lupi rispetto ad altre razze, contribuendo all'immissione degli alleli del cane nel genoma del lupo, dando vita quindi a un serissimo problema di conservazione delle diverse popolazioni di lupo.

Oggigiorno, gli strumenti genomici hanno fatto passi da gigante e offrono opportunità senza precedenti per esplorare il panorama genetico di una razza. Oggi è possibile aumentare le pratiche di selezione, di monitoraggio e di limitazione di molte malattie recessive e scoraggiare incroci illegali e frodi.
Sfortunatamente, queste possibilità non sono ancora state sfruttate per il CLC e solo pochi studi, finora, si erano interessati alla composizione genetica di questa razza. Questo studio, al contrario, sfruttando i migliori sistemi in circolazione (come l'applicazione di Chip SNP canino a 170k e approcci multivariati bayesan e di ricerca dei geni) si è posto come obiettivi:

1. Un'analisi sulla diversità genomica del CLC e la sua distanza e differenza rispetto alle popolazioni parentali (Pastore tedesco e Lupo dei Carpazi) e ad altre razze comuni
2. Confrontare la diversità genetica e i parametri demografici valutati dai marcatori del genoma con quelli desunti dai pedigree registrati
3. Ricostruire l'ascendenza di alcune caratteristiche genetiche (blocchi cromosomici): se derivate dal lupo o dal Pastore Tedesco
4. Grazie alla disponibilità del genoma di riferimento del CLC, identificare i geni candidati che potrebbero determinare alcuni tratti fenotipici della razza

 La rapida crescita del numero di CLC registrati nel mondo dimostra quanto il valore economico di questa razza stia subendo un'impennata e questo, a sua volta, rende ancora più impellente il bisogno di approfondire le basi genetiche dei suoi tratti morfologici e caratteriali, con particolare attenzione a come alcune malattie stiano cambiando nel corso delle generazioni.
In questo studio viene presentata, per la prima volta, la descrizione genomica più completa che sia mai stata fatta per il CLC fino ad ora: genotipizzando 12  individui a 170k SNP e confrontando la loro diversità genomica con campioni il più rappresentativi possibile delle loro popolazioni parentali (Lupi dei Carpazi e Pastore Tedesco) e ai profili genomici di altre 30 razze di cane, disponibili al pubblico grazie al Progetto LUPA.
Da uno screening genomico preliminare, i CLC appaiano altamente differenziati (approfondimento)da tutte le altre razze analizzate e sono anche ben distinti da entrambe le popolazioni parentali. L'approccio utilizzato (PCADMIX) ha indicato percentuali di lupo (approfondimento) più grandi (>25%) nel genoma dei CLC analizzati. Queste proporzioni si conformano bene con le stime basate sul pedigree, confermando che l'approccio utilizzato (ossia un approccio basato su un blocco aplotipico) è uno strumento affidabile e appropriato per valutare le reali proporzioni genomiche.
I nostri risultati sui livelli di eterozigosi osservati sull'intero genoma del CLC sono coerenti con altri studi, basati su diversi tipi e numeri di marcatori. In particolare, i valori di eterozigosi autosomica (ossia la presenza di una coppia di alleli diversi per un dato gene in cromosomi non sessuali) nel nostro piccolo campione di CLC sono leggermente più alti di quelli osservati nelle popolazioni parentali ma coerenti, come valori, con la recente mescolanza avvenuta nella creazione della razza, che è ancora visibile nelle grandi regioni genomiche che ospitano blocchi di aplotipi sia di cane che di lupo. Queste regioni genomiche rappresentano delle oasi di eterozigosi elevata, anche dopo circa 30 generazioni dalla fondazione della razza e circa 11 generazioni dopo l'ultimo outcrossing ufficiale. Per fortuna, quindi, la realtà mostra dei dati in contrasto con il rischio previsto all'inizio della possibile diminuzione dell'eterozigosi dovuta alla consanguineità.

L'analisi dei ROH (ossia dei segmenti continui di DNA in omozigosi) ci ha permesso di ricostruire meglio la storia della razza e di chiarirne le dinamiche. I CLC hanno mostrato un numero maggiore di ROH rispetto ai progenitori, riflettendo i recenti eventi di consanguineità verificatesi durante e dopo l'origine della razza. Inoltre, coerentemente con il basso numero di fondatori utilizzati all'inizio della selezione, i CLC hanno mostrato valori di Coefficiente di Inbreeding (FROH) più alti di entrambi i gruppi parentali (progenitori) e, anche, valori di parentela tra individui in generale più alti. Sebbene un confronto diretto tra dati genomici e informazioni genealogiche dovrebbe essere trattato con cautela date le diverse metodologie su cui si basano questi due tipi di calcoli, le stime dei livelli di inbreeding calcolati dalla frequenza delle regioni omozigote (FROH) sono paragonabili a quelle calcolate con il coefficiente di consanguineità (COI su tutte le generazioni) derivato dai dati genealogici disponibili, ossia i pedigree (approfondimento).
Tale concordanza conferma l'affidabilità di diversi metodi nell'individuare l'inbreeding, che è cruciale per gli allevatori poiché accoppiamenti tra individui strettamente imparentati possono influenzare negativamente la prole, a causa dell'aumentata probabilità che gli alleli deleteri siano espressi nei fenotipi dei cuccioli.
Viceversa, in diversi casi il coefficiente di parentela (COR) tra individui, stimati analizzando i pedigree, ha dato risultati discrepanti (valori più bassi) rispetto ai punteggi IBD determinati dai profili genetici. Tali discrepanze potrebbero essere dovute alla maggiore capacità dell'analisi basata sui metodi genomici di identificare gli effetti delle segregazioni casuali (ossia il rimescolamento casuale degli omologhi materni e paterni) rispetto all'analisi basata sul metodo dell'analisi dei pedigree oppure alle incertezze dei registri genealogici, in cui gli allevatori potrebbero aver deliberatamente non segnalato alcuni incroci tra individui consanguinei, per fini commerciali. Tra le due ipotesi, la seconda, è la meno probabile dato il lavoro molto rigoroso operato dai militari nelle prima fasi di selezione del CLC.

Pertanto, le ricostruzioni genomiche rappresentano uno strumento utile per gli allevatori al fine di attuare strategie di accoppiamento attentamente pianificate con lo scopo di prevedere e contrastare possibili effetti deleteri quali i disordini genetici letali o la riduzione della fertilità, oltre che, ovviamente, per ridurre i livelli di consanguineità per generazione tenendo conto non solo delle parentele classiche ma anche degli effetti casuali della ricombinazione genetica.

La nostra caratterizzazione dell'intero genoma ci ha permesso di verificare i tempi delle ibridazioni dei CLC analizzati, che si confrontavano bene con le fasi chiave della selezione della razza, deducibili dai pedigree, cioè l'inserimento ripetuto di alleli del lupo (ibridazioni) che ufficialmente continuarono fino al 1983. Questi risultati dimostrano che i metodi di datazione basati sull’analisi genomica possono essere efficaci e complementari nel tracciare i recenti eventi di ibridazione sia nelle razze ibride come il CLC che nelle popolazioni selvatiche.

 Nonostante il numero crescente di individui registrati, la NE (Dimensione Effettiva di Popolazione, un parametro genetico per descrivere la quantità di deriva genetica) complessiva è diminuita dall'origine della razza fino al presente. Questa tendenza decrescente è probabilmente dovuta alla progressiva selezione artificiale e al cosiddetto "effetto fondatore", ossia la sovra rappresentazione del contributo genetico di cani popolari. Viceversa, le fluttuazioni NE, con quattro picchi principali intorno agli anni 1959, 1968, 1974 e 1986, sono coerenti con gli incroci ufficiali di cani x lupo 1958/60, 1968, 1974 e 1983 (approfondimento).
Tuttavia, abbiamo rilevato, inaspettatamente, un ulteriore leggero aumento di NE intorno al 1995, che potrebbe essere dovuto al contributo genetico di un lignaggio distinto di CLC (ad esempio dall'incrocio di discendenza slovacca e ceca rimaste separate), o potrebbe essere il segnale di un non dichiarato contributo del lupo che si è verificato dopo il riconoscimento ufficiale della razza.
Fortunatamente, questo rapido declino del NE non ha eroso tutte le variazioni addizionali fornite dai fondatori lupi, poiché i livelli di eterozigosi sembrano essere ancora leggermente più alti nei CLC analizzati che nei Pastori Tedeschi analizzati.

Osservando graficamente la composizione genomica dei CLC, i risultati di PCADMIX hanno mostrato un mosaico variegato (approfondimento) degli antenati nei cromosomi, che va dalle regioni interamente dedite al cane a quelle prevalentemente riconducibili al lupo. Una ricerca genica basata su regioni ancestry-outlier ottenute da più metodi, ci ha permesso di identificare nel CLC più di 300 geni con un eccesso del progenitore lupo e più di 2000 geni con un eccesso del progenitore Pastore Tedesco.
I geni chiave di derivazione lupo che abbiamo identificato sono principalmente legati alle dimensioni corporee e ai tratti della forma, che possono spiegare la somiglianza morfologica complessiva dei CLC con i lupi. In particolare, sono stati rilevati due geni in eccesso di lupo, ASTN2 ed ENO1, che sono stati descritti nel genoma umano adiacenti a loci responsabili della produzione di tessuto osseo e cartilagineo e che in precedenza erano stati individuati nei lupi europei. Altri 9 geni derivati dai lupi sono stati collegati a caratteristiche morfologiche chiave, come l'occipite prominente (ITCH), il ponte nasale prominente (CLIP1, WDPCP), muso stretto (AP4M1, CLIP1), orecchie corte (CAMTA1), bocca stretta e piccola (KCNAB2 , CAMTA, AP4M1, CLIP1), mento appuntito (CLIP1, AP4M1), muscolatura del viso forte (CLIP1, AP4M1, HNRNPA2B1), zampe e ossa robuste (AGGF1, BMP3), tutti tratti tipici della razza.

 Altri geni di eccesso di lupo sono stati descritti come associati alla comunicazione e al comportamento. In particolare, CRHBP, che codifica per la proteina legante un ormone rilasciante corticotropina, è un gene che si manifesta durante la gravidanza, coinvolto nel comportamento anomalo materno aggressivo nei confronti dei cuccioli osservato sia nei topi che nelle femmine di razza Australian Working Kelpie. Tale comportamento peculiare è ben noto anche nei cani lupo cecoslovacchi, dove le madri che uccidono la loro prole poco dopo il parto sono state più volte osservate. Un altro gene (il PCDH15) è stato identificato come un gene correlato all'ecolocalizzazione nei mammiferi ed è stato descritto come sottoposto a selezione in diversi contesti ecologici nei lupi.
Allo stesso modo, altre varianti geniche del lupo sono correlate a disturbi cardiaci (KCNAB2, WDPCP), pancreatici (PLCG2), ossei e retinici (NPHP4) che sono stati ampiamente individuati in un certo numero di razze canine, ma non ancora nei lupi, e ciò potrebbe fornire la spiegazione della resistenza più elevata dei CLC a tali disturbi rispetto ai pastori tedeschi. Al contrario, un certo numero di tratti comportamentali voluti dagli allevatori potrebbe essere ospitato in una vasta serie di geni derivati dal cane, spesso coinvolti nello sviluppo del cervello, che è stato dimostrato essere un obiettivo fondamentale dell'addestramento. In particolare, due geni sono correlati alla differenziazione neurale e alla formazione del sistema nervoso (TGIF1 e CNTN5) e il gene TMEM132D. Allo stesso modo, abbiamo identificato un numero di varianti geniche del cane che svolgono ruoli importanti nei processi di apprendimento e memoria, come l’OXT, che possono influenzare la cognizione canina, la tolleranza, l'adattamento e il comportamento materno, le capacità visive e uditive, come il PCDH15, e nella regolazione dei ritmi circadiani, del peso corporeo e della digestione, come il NOCT, che potrebbe essere cruciale nell'adattare l'attività fisiologica dei CLC a quella dei loro proprietari umani (i lupi al contrario del cane e del CLC, sono animali notturni, n.d.r.). È interessante notare che abbiamo anche rilevato alcuni geni descritti come correlati alla socialità: come il COMT, un gene coinvolto nella catalisi della dopamina e nella regolazione dei comportamenti aggressivi e dell'attenzione in molte razze, e il SEZ6L, entrambi mappati sul cromosoma 26 e descritti come significativamente associati con il tempo che i cani trascorrono in stretta vicinanza degli esseri umani, rafforzando l'ipotesi che la trasformazione delle reazioni difensive negative verso gli umani in risposte positive avrebbe potuto essere un passo primario nel primo step della domesticazione del cane.
Selezionare, a livello di carattere, la docilità (ossia la capacità del cane di accettare volutamente l’uomo come suo naturale superiore, senza che questo debba continuamente ricorrere ad interventi repressivi sul cane), sia in maniera volontaria che involontaria, ha avuto un ruolo chiave nell’evoluzione di un certo numero di altri animali, sia addomesticati che selvatici, dimostrando che un certo numero di altri tratti genetici sono stati influenzati unicamente dalla selezione di questo carattere. Esempi di questo processo sono rilevabili nello studio di Keyston di Balyaev sulle volpi argentate che ha portato al concetto di Sindrome di domesticazione generale per indicare un insieme di tratti fenotipici comuni a un numero di specie domestiche.

 Abbiamo rilevato altri quattro geni in eccesso di cane, IGF2BP2, SLC7A11, ACSS2, e GRIK2, correlati al metabolismo lipidico e alla sintesi di energia che potrebbe indicare l'importanza delle modificazioni dietetiche durante il processo di domesticazione, in particolare durante la fase di creazione della razza. Abbiamo anche trovato due geni (ASIP e RALY) coinvolti nella regolazione della colorazione del mantello mediante la sintesi del pigmento giallo, che potrebbe conferire il tipico colore alla razza. È interessante notare che recenti evidenze hanno dimostrato che le variazioni nell'ASIP, che sono state riscontrate anche in antiche razze asiatiche, possono influenzare anche il comportamento sociale, confermando che le caratteristiche morfologiche e comportamentali nei canidi possono essere fortemente correlate. Tuttavia, abbiamo identificato anche una serie di geni di eccesso di cane precedentemente descritti in letteratura per essere collegati a un numero di disturbi comuni del cane come la cardiomiopatia aritmogena del ventricolo destro (STRN), atrofia progressiva della retina (SLC4A3), anomalia oculare del collie (NHEJ1), distrofia cono-asta (ADAM9) e amaurosi congenita di Leber canino, precedentemente nota come cecità notturna stazionaria congenita (RPE65), che sono tipici della popolazione dei genitori di Pastore Tedesco e che potrebbero essere  stati mantenuti durante la forte selezione artificiale che si è verificata durante la creazione del CLC.

 Concludendo, il nostro studio fornisce la prima caratterizzazione dell'intero genoma del CLC, evidenziando come la razza, nonostante il basso numero di fondatori, attualmente mostri livelli relativamente elevati di eterozigosi grazie all’ibridazione da cui deriva. Il nostro approccio sull'intero genoma ha confermato di essere un metodo valido per ricostruire la storia della razza e datare le sue dinamiche, per valutare le reali proporzioni del progenitore del lupo (% di sangue) di singoli individui, nonché il loro rapporto di parentela. Pertanto potrebbe fornire uno strumento valido anche per le applicazioni forensi al fine di smascherare eventuali commerci di individui venduti come puri ma che hanno origine da incroci illegali o con lupi selvatici, che sarebbe difficile da identificare attraverso procedure di assegnazione multivariate e bayesiane basate su un numero limitato di loci (procedure usate fino ad oggi, n.d.r.) o solo sulla loro morfologia.Inoltre, il nostro approccio di ricerca genica, reso possibile dalla disponibilità di un genoma di riferimento ben annotato, ci ha permesso di identificare un primo gruppo di geni la cui espressione e interazione probabilmente determinerebbe il tipico aspetto simile a lupo della razza. È interessante notare che la maggior parte dei geni associati alle funzioni cerebrali, al comportamento, al metabolismo e ai disturbi rilevati sono derivati dal cane, come previsto in una razza che, nonostante le sue recenti origini ibride, mostra principalmente fenotipi (per comportamento e patologie, n.d.r.) tipici del cane. Il miglior esempio è rappresentato dal gene COMT, che è stato descritto come il gene candidato per la socialità nei cani e solo gli alleli del cane sono stati individuati nel pool genico dei CLC analizzati. Tuttavia, trovare le mutazioni casuali per i tratti singoli necessita di ulteriori ricerche, in particolare per i tratti poligenici. La futura genotipizzazione di un numero maggiore di individui con pedigree certificati provenienti da diversi lignaggi campionati in tutto il mondo contribuirà a una comprensione più profonda di molte caratteristiche genetiche, morfologiche e comportamentali di questa razza. L'ottimizzazione di un pannello indicatore piccolo e rapido, ad esempio di 96 SNP, comprese mutazioni per malattie comuni o comportamenti particolari, potrebbe aiutare a monitorare la salute di tutti gli individui in cattività commercializzati e consentire la loro identificazione genomica, contrastando incroci non segnalati e il commercio illegale di lupi selvatici.

Alessio Camatta

Articolo inserito il 19/07/2018